医学论文SiRNA逆转肺耐药相关蛋白表达介导的白血病细胞多药

来源：职称驿站所属分类：基础医学论文发布时间：2015-05-13 14:17:37浏览：次

　　《医药论坛杂志》创办于1980年，原名《河南医学情报》，双月刊;1993年更名《河南医药信息》，月刊，56页;2001年8月改为半月刊，64页，2003年3月更名为《医药论坛杂志》，80页。2004年2月加入中华预防医学会系列杂志，2005年12月经中华人民共和国新闻出版总署同意，主管单位由河南省卫生厅变更为卫生部，主办单位由河南省医学情报研究所变更为中华预防医学会、河南省医学情报研究所。

　　【摘要】目的：研究双链短干扰RNA(siRNA)对白血病多药耐药细胞模型(K562/NaB)肺耐药相关蛋白(LRP)表达及功能的影响. 方法：针对LRP基因设计合成特异性siRNA，在脂质体介导下转染K562/NaB;采用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测K562细胞LRP mRNA的水平;用流式细胞术检测K562/NaB细胞LRP蛋白表达的变化和细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积;MTT法检测阿霉素(ADM)对K562/NaB细胞耐药的半数抑制浓度(IC50). 结果： siRNA转染后：K562/NaB细胞的LRP mRMA水平明显降低;LRP蛋白表达由阳性转为阴性;细胞内DNR的蓄积明显增加，DNR平均荧光增强3.28倍;对ADM药物敏感相对逆转效率为78.18%. 结论： siRNA可逆转由LRP介导的白血病细胞多药耐药.

　　【关键词】 RNA,小分子干扰,肺耐药相关蛋白,K562细胞,抗药性,医学论文

　　0引言

　　肺耐药相关蛋白(lungrelated resistant protein， LRP)是一种新型的与多药耐药(multidrug resistance， MDR)相关的糖蛋白，主要导致细胞内药物聚集缺陷，而在多种肿瘤细胞内引起MDR. 在儿童白血病以及成人髓系白血病(AML)中，LRP表达是独立的预后决定因素之一，其过度表达造成患者对化疗不敏感，提示预后不良[1-2]. 双链短干扰RNA(short interfering RNA， siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference， RNAi)，是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面的最新突破[3-4]. 我们在建立了经丁酸钠(sodium butyrate， NaB)诱导人AML系 K562细胞，高表达LRP并介导多药耐药的细胞模型(K562/NaB)的基础上[5]，设计合成了LRP特异性siRNALRP，并转染上述细胞模型，观察siRNALRP抑制LRP基因和蛋白表达、消除LRP改变细胞内药物蓄积和分布作用的效果，以期为逆转LRP介导的肿瘤细胞MDR、提高儿童难治性和复发性白血病化疗效果探索新的方法，并探讨以siRNA介导的RNAi用于肿瘤细胞MDR治疗的可行性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　AML细胞系K562细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所;单克隆抗体LRP56为Monosan公司产品;固定和破膜试剂盒、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)荧光标记羊抗鼠IgG抗体为Caltolog Laboratories产品;NaB为Sigma公司产品.

　　LRP特异性短干涉RNA(siRNALRP)自行设计，由Dharmacon公司合成. 浓度20 μmmol/L，序列：5′ GCU CUU UUC AGU GCC AGA C dTdT (正义链)，dTdT CGA GAA AAG UCA CGG UCU G 5′ (反义链).

　　1.2方法

　　1.2.1K562细胞培养和高表达

　　LRP的K562多药耐药细胞模型(K562/N)[10]K562细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基于37℃, 50 ml/L CO2条件下培养. K562细胞在含2 mmol/L NaB的培养液中处理3 d，制作K562细胞高表达LRP的多药耐药细胞模型，命名为K562/NaB. 阴性对照组不加NaB.

　　1.2.2siRNA转染

　　实验K562/NaBsiRNA组：取K562/NaB细胞接种于24孔板内，每孔500 μL，浓度为3×108/ L. 分别以无血清RPMI 1640培养液 50 μL稀释siRNALRP, Lipofectamine各1 μL，混匀静置后加入细胞悬液. 再加入NaB使终浓度为2 mmol/L，进行细胞培养. 每24 h以含2 mmol/L NaB的RPMI 1640培养基500 μL换液，连续3 d. 转染后24, 48, 72 h分别取细胞进行相关检测.

　　K562/NaBH2O组：取K562/NaB细胞，以无RNase水代替siRNALRP转染细胞，操作方法、实验条件同siRNA转染组. 取转染72 h细胞进行检测.

　　对照组： K562/NaB细胞作为阳性对照;原始的K562细胞作为阴性对照.

　　1.2.3RTPCR方法检测

　　K562细胞LRP mRNA水平同时取实验和对照组细胞各1×106，以Trizol提取总RNA，以RTPCR检测LRP mRNA水平. 反转录以Oligo(dt)15作为引物，37℃ 1 h. PCR引物：LRP上游引物：5′GAT CCG ACC AGT CAG AAG CCG AG3′，下游引物：5′AAT TCA CTT CTT CAC CTC CAC CTC AGC C3′，扩增产物300 bp. 内对照GAPDH上游引物：5′AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA3′，下游引物：5′CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3′，扩增产物590 bp. 扩增条件：95℃ 1 min，然后按94℃ 40 s, 58℃ 45 s, 70℃ 45 s，循环 30次，最后以72℃ 10 min结束反应. RTPCR产物电泳，LRP条带和GAPDH条带吸收峰比值LRP/GAPDH0.3，视为LRP mRNA表达阳性.

　　1.2.4流式细胞术检测

　　K562细胞LRP蛋白表达以LRP的单克隆抗体LRP56为一抗，PE标记的羊抗鼠IgG为二抗，标记各组K562细胞，在流式细胞仪上检测其LRP蛋白的表达情况. 同时取实验和对照组的细胞各1×106，依次加入前固定液、打孔剂和LRP56单抗混合物、PE标记羊抗鼠IgG，避光保存. 各步骤间以含1 ml/L 叠氮钠、100 ml/L 小牛血清的PBS 洗涤细胞2次. 标记4 h内上流式细胞仪检测LRP蛋白表达，LRP阳性细胞5%视为阳性结果.

　　1.2.5流式细胞术检测

　　细胞内柔红霉素(daunorubicin, DNR)蓄积同时取K562/NaBsiRNA组转染72 h的细胞、K562/NaBH2O组和阳性对照、阴性对照细胞各2×106，在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中调整细胞浓度为1×109/L，加入DNR使终浓度为1 μmol/L，于37℃, 50 mL/L CO2,饱和湿度条件下培养2 h. 洗涤后立即以流式细胞仪FL 2通道在相同条件下随机检测10 000个细胞. 以不加DNR的K562细胞作为空白对照.

　　1.2.6MTT法检测

　　ADM的IC50同时取K562/NaBsiRNA组转染72 h的细胞、K562/NaBH2O组和阳性对照、阴性对照细胞，调整细胞浓度至1×108/L，在96孔板的各孔中加入180 μL细胞和不同浓度(0.1 μg ~100.0 μg)的ADM，培养72 h后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，继续孵育4 h，570 nm波长处测定吸光度(A)值. 按以下公式分别计算相对逆转效率. 相对逆转效率=(IC50A- IC50B)/(IC50A-IC50C). 其中IC50A是K562/NaB细胞的IC50，IC50B是转染siRNA的K562/NaB细胞的IC50，IC50C是K562细胞的IC50.

　　统计学处理：采用χ2检验和OneWay ANOVA检验. P0.05认为具有统计学意义.

　　2结果 1K562/NaB细胞LRP mRNA水平的变化

　　K562/NaBH2O组、阴性对照、阳性对照LRP mRNA表达阳性，其中阴性对照LRP/GAPDH 0.53，H2O转染组、阳性对照LRP/GAPDH分别为0.96, 0.98，较阴性对照明显升高. K562/NaBsiRNA组中，转染24, 48, 72 h, LRP mRNA检测均为阴性，较K562/NaBH2O组、阳性对照、阴性对照明显减低(图1). 2K562/NaB细胞LRP蛋白表达的变化

　　K562/NaBsiRNA组转染48 h和72 h的细胞、阴性对照细胞LRP表达阴性;K562/NaBsiRNA组转染24 h的细胞、H2O转染组、阳性对照LRP表达阳性. 当阴性对照LRP阳性率为1.77%时，K562/NaBH2O组、阳性对照LRP阳性表达率分别为36.11%和35.10%，后二者LRP表达无明显差异(P0.05);K562/NaBsiRNA组中，转染24 h, 48 h, 72 h后，LRP阳性率分别为14.98%, 1.39%和1.55%，转染24 h后LRP表达较K562/NaB H2O组、阳性对照明显减少(P0.01);转染48, 72 h后， LRP阳性表达较转染24 h明显减少(P0.01).

　　2.3DNR在K562/NaB细胞内蓄积的变化

　　加入DNR的实验组细胞出现明显的荧光，未加入DNR的空白对照K562细胞检测到微弱荧光(平均荧光强度为4). K562/NaBH2O组和阳性对照细胞内DNR平均荧光强度分别为38和36;阴性对照K562细胞平均荧光强度为115;K562/NaBsiRNA组转染72 h的K562细胞内DNR平均荧光强度为118，较K562/NaBH2O组细胞内DNR平均荧光强度增强了3.28倍(图2). 4K562/NaB细胞药物敏感性的变化

　　siRNALRP作用72 h后的K562/NaB细胞对ADM的敏感性增加，药物敏感相对逆转效率为78.6%(表1). 表明siRNALRP可以恢复K562/NaB细胞对化疗药物的敏感性. 表1siRNAs对ADM作用于K562/NaB细胞的IC50的影响(略)

　　3讨论

　　在多种生物中，外源双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)导入细胞中，与其同源的mRNA受到降解，其相应基因受到抑制，称为RNA干涉(RNA interference, RNAi)[6-8]. 研究表明[9-10]，体外合成的小分子dsRNA能直接触发RNAi，这些小分子dsRNA被称为小干涉RNA(small interfering RNA)，即siRNA. siRNA介导RNAi的机制主要由RNAi核酸酶催化，该酶包括一个dsRNA结合区，一或多个RNA酶区域，以及一个RNA解旋酶区域. 首先dsRNA与RNA核酸酶结合，并被分解成为的2123nt的 siRNA，与该酶稳定结合形成360 kDa的蛋白质RNA复合体. siRNA特异地与同源mRNA结合，解旋酶区域催化mRNA与siRNA的正义链交换. 最终mRNA被降解，并再生成siRNA与RNAi核酸酶的复合体. 目前，RNAi技术以其高效性、特异性，在基因沉默中得到广泛应用，对于肿瘤细胞多药耐药基因的消除是其应用的热点之一.

　　我们设计合成了针对LRP的特异性siRNA，用以转染K562细胞高表达LRP的细胞模型，初步探讨特异性siRNA降解LRP的mRNA、降低LRP蛋白的表达的作用、消除LRP的药泵功能的效果. 本研究的发现，以siRNALRP转染NaB诱导3 d的K562细胞，转染24 h，LRP mRNA水平明显下降，转为阴性;LRP蛋白水平明显下降;转染48 h, 72 h, LRP LRP mRNA和LRP蛋白表达仍均为阴性. 在LRP改变细胞内化疗药物蓄积和对化疗药物耐药性方面，经siRNALRP转染72 h，K562/NaB细胞内DNR蓄积增加，恢复到原始的K562细胞水平，对ADM的耐药性明显降低.

　　上述结果表明，siRNALRP能够有效降解K562细胞LRP mRNA，使LRP蛋白表达受到抑制，并因此消除了LRP介导的MDR作用，因此有望成为逆转LRP介导肿瘤细胞MDR的有效方法.

《医学论文SiRNA逆转肺耐药相关蛋白表达介导的白血病细胞多药》

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