医学核心期刊论文发表重组大肠杆菌生产人表皮生长因子发酵条件的优化研究

　　大肠埃希氏菌(E. coli)通常被称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)和弥散粘附性大肠杆菌(DAEC).。大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌(G-)。

　　【摘　要】提高人表皮生长因子产量,优化发酵条件,对于发酵过程在中参数优化，采用10L发酵罐培养，针对接种量、诱导时间、接种龄等发酵参数中，筛选出影响产量的显著因素,优化发酵过程参数。医学核心期刊论文发表以下是本篇研究关于重组大肠杆菌生产人表皮生长因子发酵条件的优化问题。

　　【关键词】人表皮生长因子;重组大肠杆菌;发酵条件

　　引言

　　研究溶氧、温度、PH、通风比等对于发酵过程的影响，以及诱导OD对于发酵过程的影响，控制发酵过程参数，优化底料培养基、补料培养基，保证产酸稳定，提高产酸率和糖酸转化率。以下本文对此做具体介绍。

　　一、人表皮生长因子介绍

　　人表皮生长因子，是带有53个氨基酸残基活性片段，且对热以及蛋白酶分解作用稳定的片段，人表皮生长因子能刺激皮肤组织细胞代谢，加速角膜创伤修复，增强表皮细胞内蛋白质与RNA间的合成【1】。人表皮生长因子能够减少光对皮肤带来的损害，也可以减少细胞氧化,有效防止以及减少皮肤皱纹。故此，加大人表皮生长因子生产，优化人表皮生长因子发酵条件，优化培养，具有广阔的应用前景。

　　二、发酵生产实验

　　1.材料

　　菌种与质粒1质粒(UV 5par8egf),菌种(E.coli,JM101),通过质粒转化得重组菌,编号为E。coliHJ101。培养基组成:蛋白胨16g/L,酵母粉10 g/L,NaCl 10 g/L,另外加入100mg/L经微孔滤膜过滤的AMP(氨苄青霉素),并且在固体培养基中加琼脂。其发酵培养基组成为:葡萄糖5 g/L,微量元素混合液3mL/L,Amp(100Lg/mL)(经微孔滤膜除菌)。微量元素组成:FeCl3•6H2O(0.162 g/L,ZnCl2•4H2O( 0.0144g/L),CoCl2•6H2O(0.12 g/L),Na2MoO4•2H2O (0.012g/L),CaCl2•2H2O (0.006 g/L),CuSO4•5H2O(1. 9g/L),H3BO(30.5 g/L;HCl(37%)(37 mL/L)。

　　2.方法

　　种子扩大培养,将菌种稀释涂布平板, 24 h之后可以得到单菌落,挑取生长较好的菌落进行移接培养，24 h后将250 mL移接种子液加入摇瓶培养6h(30e,200 r/min),形成发酵液。控制发酵过程，溶氧达到20%以上,发酵温度为32℃,MBL培养基中AMP添加量为100Lg/mL;在微生物对数生长期中后期，加入浓度为0.2 mmol IPTG进行诱导,并控制pH值为6.8左右,诱导后pH值自然。

　　3.分析检测分析方法

　　人表皮生长因子的检测中，采用HPLC测定产物含量，蛋白分析柱(StableBond WidePore Reversed-PhaseC8Column)柱长250mm,柱径4.6mm,粒子尺寸5mm。流动相采用A液10%乙腈+90%磷酸缓冲液(pH 7.4),B液70%乙腈+30%磷酸缓冲液(pH7.4);检测波长280 nm;柱温25e。

　　光密度法测定菌浓;DNS法测定还原糖。

　　三、优化发酵条件及结果分析

　　1.结果分析

　　经以上实验研究，Amp的加入，会有助于人表皮生长因子在培养基的积累.当Amp增加到100 mg/L时,人表皮生长因子浓度提高了24.95%,进一步增加Amp添加量,人表皮生长因子表达没有提高.当Amp加入到培养基中,质粒内酰胺酶可被降解,不能完全抑制P-菌生长【2】。在人表皮生长因子培养基中，加入抗生素(Amp 100 mg/L),有利于发酵人表皮生长因子。

　　2.优化发酵诱导时间

　　在发酵中，对于重组菌,加入外源质粒,重组菌发酵将会提高质粒稳定性与产物可得率。在人表皮生长因子菌体不同生长期，及人表皮生长因子对数生长期, 人表皮生长因子中期, 人表皮生长因子后期和人表皮生长因子稳定期【3】，分别添加0.2 mmol的诱导剂重组大肠杆菌进行诱导,在 (6~8 h)加入诱导,可得到最大的人表皮生长因子积累量;而对于(2 h)诱导时,总的人表皮生长因子表达水平不高。

　　3.优化控制pH值

　　pH反映微生物代谢活动, pH变化会影响各种酶的活性与细胞结构【4】，在大肠杆菌发酵过程中引起pH变化的因素有很多,生理碱性盐会引起pH上升;碳氮比过小,氮源含量偏高时引起氨基氮释放,导致pH上升;生长初期, 人表皮生长因子菌体生长产生的蛋白酶水解培养基中的蛋白陈会释放NH4+,从而引起pH上升，人表皮生长因子培养基中使用的生理酸性盐硫酸馁,由于NH被吸收,会导致发酵液中pH下降;葡萄糖作为碳源时会产生乙酸、丙酮酸和柠檬酸等,引起pH的降低;菌体代谢产生的二氧化碳溶于发酵液中生成碳酸也会引起pH的降低;可见，当PH为4时，获得的菌种纯度较高，为菌种纯度临界值，PH为5，菌种纯度为2.03，不符合试验标准。

　　4.优化重组菌发酵过程

　　在重组菌发酵过程中，其葡萄糖消耗情况中，由于葡萄糖对菌体生长以及人表皮生长因子水平会产生影响，因此为提高含质粒细胞浓度,从而提高人表皮生长因子表达水平，按2 g/L总糖质量浓度流加葡萄糖，优化人表皮生长因子重组菌发酵过程，改善了大肠杆菌碳源供应,提高大肠杆菌对hEGF表达水平。同时，对重组菌发酵结束后，测定质粒稳定性 ,流加一定量的MgSO4•7H2O，将0.3 gMgSO4•7H2O同时流加,提高质粒的稳定性。

　　四、结论

　　综上所述，提高人表皮生长因子提取收率，降低分离纯化人表皮生长因子难度, 避免细胞破碎时众多细胞蛋白的干扰，直接从发酵液上清液中纯化提取人表皮生长因子，优化人表皮生长因子发酵条件，使人表皮生长因子在重组大肠杆菌中得到高效表达，使重组菌hEGF产率达101.9 mg/L,比从前产量提高30%，具有一定经济优越性。

　　参考文献：

　　[1]丁兰宝.重组大肠杆菌高密度发酵研究[D].江南大学,2012,07(18):41-42.

　　[2]常海燕.重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ工艺研究[D].西北大学,2012,24(32)：54-57.

　　[3]王维卓.重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ发酵过程优化[D].西北大学,2011,06(34):45-46.

　　[4]花秀夫.重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白动力学研究[D].西北大学,2010,21(14):56-57.

　　《临床医学工程》杂志是经国家新闻出版总署批准(新出报刊〔2008〕946号)，由国家医疗保健器具工程技术研究中心(广东省医疗器械研究所)主办的学术类科技期刊。以“服务于临床医务工作者和医学工程人员”为办刊宗旨。国内统一刊号：CN 44-1655/R，国际标准刊号：ISSN 1674-4659;国内邮发代号：46-130，国外发行代号：M8885

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