用农作物秸秆生产生物絮凝剂的研究

　　摘要： 从土壤中分离一株纤维素降解菌HIT-3，其降解纤维素还原糖产率可达16.34%。将其用于农作物秸秆预处理，使其中的纤维素大分子物质降解为小分子底物，降解产物再用于生产生物絮凝剂。试验证明，秸秆生物降解产物用于生产生物絮凝剂，絮凝效果良好，与葡萄糖底物发酵效果基本相同，最高絮凝率可达80.5%。采用秸秆生产生物絮凝剂，为降低生物絮凝剂的工业化生产成本提供了理论依据。

　　关键词： 秸秆,纤维素降解菌,两段式发酵,生物絮凝剂

　　0 引言

　　秸秆是地球上丰富而廉价的可再生资源[1]。我国是世界第一秸秆大国，仅2005年全国秸秆年产量就达到84183.12万吨[2]。除部分用作饲料外，大部分秸秆都被燃烧或腐烂掉。这样做首先是燃烧不完全的，热值低，造成严重的浪费;其次是对环境造成了严重污染。所以，开发利用这种廉价的可再生资源具有深远的意义和实用价值。

　　生物絮凝剂作为一种新型、高效、无毒、无二次污染的绿色水处理剂，发酵成本高，制约了生物絮凝剂的工业化生产和大规模应用[3,4]。若是能利用廉价的、可再生的秸秆作为原材料，生产生物絮凝剂。这样既可降低生产成本，实现工业化生产，又可保护环境，给我们带来巨大的社会效益、经济效益和环境效益，具有很好的开发前景。但是秸秆中含有大量的纤维素，絮凝菌并不能直接利用，必须先通过预处理手段将其转化成小分子物质。本试验的目的就是分离高效的纤维素降解菌，通过两段式发酵，验证此思路的可行性。

　　1 材料和方法

　　1.1 原料和菌种

　　菌种：HIT-3是从土壤中分离的纤维素降解菌;F6是本实验室原有的一株高效絮凝菌。

　　土壤、玉米秸秆：取自郊区农田

　　培养基：

　　① 浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基[5]

　　② 无淀粉滤纸：滤纸用1%的醋酸浸泡一夜后用2%的苏打水洗至中性，晾干后剪成直径为8cm左右的圆形滤纸片，放在一干净的平皿中，用报纸包好，采用湿热或干热的方法灭菌备用。

　　③ 羧甲基纤维素培养基：取250ml三角瓶，称取1.0g羧甲基纤维素放入其中，再加入赫奇逊液体培养基100ml，121℃灭菌20min。

　　④ 秸秆培养基：玉米秸秆用剪刀剪成3cm左右的小段，用清水漂洗干净，再用0.5%的NaOH溶液常温下浸泡10个小时，除去部分木质素，使纤维素暴露出来，有利于微生物和酶的作用[6]。浸泡后漂洗、烘干、粉碎。取250ml三角瓶，称取1.5g秸秆粉放入其中，再加入赫奇逊液体培养基100ml， 121℃灭菌20min。

　　1.2 方法

　　1.2.1 还原糖测定

　　还原糖浓度的测定采用DNS法[7]。还原糖产率的计算方法：

　　1.2.2两段式发酵

　　采用两段式发酵法制取生物絮凝剂[8]，第一段发酵：秸秆糖化段。将纤维素降解菌接入秸秆培养基中，合适的培养条件下完成秸秆糖化过程;第二阶段发酵：制取生物絮凝剂段。将絮凝菌接入秸秆糖化液中，制取生物絮凝剂。

　　1.2.3絮凝效果测定

　　采用5‰的高岭土悬浊液进行絮凝效果烧杯试验。具体过程见文献[3]，絮凝效果用絮凝率[9]表征：

　　其中，A为空白水样上清液浊度，B为待测水样上清液浊度。

　　2 结果与分析

　　2.1增值培养

　　把采集的土壤编号，室温风干，用20目和40目的筛子筛选土样，取两筛中间的土粒备用。

　　赫奇逊固体培养基倒平板，待其凝固后，无菌操作取上述滤纸片放在固体培养基上，再用1ml无菌生理盐水润湿滤纸，将上述处理过的土粒用无菌牙签或镊子进行点种，每皿点9个土粒。放32℃生化培养箱中保湿培养，每天观察土粒周围滤纸变化情况。培养2～3天后，土粒周围有黄色菌苔出现，到第6～7天时，菌苔扩大，在土粒周围形成淡黄色的降解圈。

　　2.2初筛

　　从出现降解圈的土粒周围挑取菌苔在赫奇逊固体平板上划线，然后盖一层灭菌滤纸，再加1ml生理盐水润湿滤纸，待滤纸上有黄色降解圈出现，再重复划线2～3次，使能降解秸秆类纤维素的细菌被进一步纯化出来。划线培养的照片：

　　把上述划线分离出来的降解速度快的菌苔挑取1～2环到100ml带有玻璃珠的灭菌生理盐水中(每瓶同时加灭菌的土温80两滴，目的是使菌团能被充分打散)，放在140转的摇床上摇3个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/mL，吸取1ml稀释菌液到赫奇逊固体平板上，用手晃动平板，待稀释菌液均匀平铺后，在平板上加盖一张无菌滤纸，32℃保湿培养6天。稀释培养的照片：

　　该类纤维素降解菌比较粘稠，滤纸本身又具有吸附性，很难通过划线把它们分纯。稀释分离通过加入的土温-80降低了菌与菌之间的粘附性，再加上玻璃珠的打散作用，菌体比较分散，再通过无菌稀释，滤纸的吸附性不会影响分离结果。所以，稀释培养的方法克服了划线培养的一些弊端，能够筛出单个菌株。根据每株菌的土样来源、在滤纸板上生长的颜色、大小、生长快慢等共分离筛选出126株菌。

　　2.3复筛

　　初筛分离得到的126株菌分别接入羧甲基纤维素培养基中进行液体发酵产糖试验，32℃，140r/min摇床培养7天，每天测其还原糖浓度变化，从中选出还原糖产率相对高的菌。目前，大多数的研究都集中在纤维素酶的提取与结构分析上，产酶与酶水解是分开进行的，文章的研究集中在使产酶和酶水解在同一体系中进行，所以在液体发酵试验中，直接测还原糖浓度变化，筛选能实现产酶和酶水解在同一体系中进行的高效菌株。要求所筛选的菌株能产生纤维素复合酶系，具有很强的纤维素降解活性，降解后的产物中还原糖的浓度较高，有利于后续发酵的进行。126株菌连续发酵七天，每天定时取样测得的还原糖浓度变化情况。这些菌最高还原糖产糖率出现的时间并不相同，有的在第二天，大部分在第三天到第四天，也有的甚至达到七天或更多天数。从实际应用的角度考虑天数越少越有利于生产。根据测得数据，选择126株菌第三天的产糖率绘制126株菌的还原糖产率柱状图，见图1.。

　　图1. 126株菌的还原糖产率柱状图

　　根据图1可统计出，126株菌发酵三天还原糖产率在不同的范围内，见表1：

　　表1 126株菌的还原糖产率范围

　　从图1和表1中，我们很容易发现编号为3和71的两株菌的产糖率明显高于其他124株菌。其他大部分的菌株的最高还原糖产率多集中在0～10%之间。3号和71号菌的还原糖产率分别为16.34%和13.54%，将它们重新命名为HIT-3和HIT-71。

　　2.4絮凝效果的测定

　　将HIT-3接入上述秸秆培养基中，32℃，140r/min摇床培养3天后，糖化产物121℃灭菌20min，接入絮凝剂产生菌F6。为了验证秸秆底物与葡萄糖底物是否具有同样的效果，同时做了葡萄糖发酵对比试验。30℃，140rpm摇床培养，每12小时测一次絮凝率。

　　图2为絮凝率比较结果：

　　图2.絮凝率效果比较

　　从图中可以看出，不论是秸秆还是葡萄糖用于生产生物絮凝剂都有很好的絮凝效果，最高絮凝率分别为80.5%和90.2%。以秸秆为底物生产生物絮凝剂，发酵前期絮凝效果并不理想，直到发酵36小时之后絮凝率才达到一个较好的效果，并趋于稳定。而葡萄糖发酵生产絮凝剂12个小时就能达到很好的絮凝效果。主要的原因是：絮凝菌F6本来就是利用葡萄糖培养基分离出来的，对葡萄糖底物有很好的适应能力，表现较好的絮凝效果。

　　3 结论

　　秸秆经微生物降解后的产物用作生物絮凝剂的生产底物，具有很好的絮凝效果。但是需要根据秸秆底物的特性，筛选絮凝效果更理想的菌株。因此开发秸秆等廉价资源，实现微生物絮凝剂的大规模生产，是一项非常有意义的研究。

　　参考文献：

　　[1] 余燕春.加快纤维素资源开发利用的思考[J].技术经济与管理研究，1999(4)：42-43

　　[2] 毕于运等.中国秸秆资源数量估算[J].农业工程学报，2009，25(12)：211-217

　　[3] 马放等.复合型微生物絮凝剂的开发[J].中国给水排水，2003，19(4)：1-4

《用农作物秸秆生产生物絮凝剂的研究》

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文章名称： 用农作物秸秆生产生物絮凝剂的研究

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